Индикация вирусов по гемадсорбции

Вирусологические методы исследования в микробиологии

Индикация вирусов по гемадсорбции

В медицине разработаны специальные методы исследования для диагностики заболеваний с вирусной природой. Это необходимо, чтобы идентифицировать вирус, изучить его биологию и способность воздействовать на клетки животного и человека. Таким образом, появляется возможность понять патогенез вирусных заболеваний и, соответственно, правильно выбрать методику лечения.

В чем заключается диагностика?

Вирусы размножаются в живых клетках. Чтобы его исследовать, необходимо культивирование на уровне подопытного организма или культуры клеток. Для этого в медицинской практике и микробиологии в целом проводятся вирусологические методы исследования, которые имеют следующие основные подходы:

  • прямой;
  • непрямой;
  • серологический.

Пенализация и депенализация – это… Понятие, определение и виды в уголовном праве

Материал могут исследовать непосредственно на наличие нуклеиновых кислот, вирусного антигена или, например, изолировать и идентифицировать вирус из клинического материала.

Кроме возможности установить этиологию заболевания, мониторинга терапевтического эффекта, вирусологические методы исследования играют большую роль в противоэпидемических мероприятиях. Для выделения и культивирования вируса используют куриные эмбрионы, лабораторных животных или культуры клеток.

Как исследуют?

Канал ДНЕВНИК ПРОГРАММИСТА Жизнь программиста и интересные обзоры всего. , чтобы не пропустить новые видео.

Самый быстрый – это прямой метод. Он позволяет обнаружить вирус, антиген или НК (нуклеиновую кислоту) в самом клиническом материале. Занимает время от двух часов до суток.

  • ЭМ – электронная микроскопия. Обнаруживает непосредственно вирус.
  • ИЭМ – иммунная электронная микроскопия. Использует специфические антитела к вирусам.
  • РИФ – реакция иммунофлюоресценции. Использует антитела, связанные с красителем. Такие вирусологические методы исследования широко применяются в качестве быстрой расшифровки этиологии ОРВИ (острых респираторных вирусных инфекций), когда берут мазки-отпечатки со слизистой оболочки верхних дыхательных путей.
  • ИФА – иммуноферментный анализ – определение вирусных антигенов, похожее на РИФ, но основанное на мечении антител ферментами.
  • РИА – радиоиммунный анализ. Использует метку антител радиоизотопами для обеспечения высокой чувствительности в определении вирусного антигена.
  • Молекулярный – гибридизация НК или выделение геномов вируса при помощи ПЦР (полимеразной цепной реакции).
  • Цитология – применяется редко, но при определенных инфекциях эти вирусологические методы исследования очень эффективны. Исследуются материалы биопсии, аутопсии и мазки, обрабатываемые с целью окрашивания и анализа под микроскопом.
  • В чем смысл исследований?

    Куда направлен вектор импульса тела? Чему сонаправлен вектор импульса тела?

    Для успешного выделения вирусов клинический материал берут в соответствии с патогенезом и как можно раньше. Часто этот процесс требует проведения нескольких пассажей, прежде чем применить определенные вирусологические методы исследования.

    Микробиология изучает микроскопические существа. И ее область – это не только медицина. Она является основополагающей наукой для сельского хозяйства, ветеринарии, космической и технической промышленности, геологии.

    Но безусловно все создано для человека и его развития на этой прекрасной планете. Поэтому очень важно вовремя обнаружить опасность и нейтрализовать ее. Вирусы отличны от бактерий.

    Это структуры, попадающие в организм и вызывающие образование нового поколения.

    Они похожи на кристаллы и направлены на управление процессом своего размножения, хотя сами не питаются, не растут и не выделяют продуктов обмена.

    Вирус способен вызвать тяжелое заболевание у любого живого организма, в который он попал. К тому же он может эволюционировать. Именно поэтому вирусологические методы исследования в микробиологии должны развиваться и совершенствоваться, так как под угрозой может быть человеческая цивилизация в целом.

    Материалы

    Для обнаружения и идентификации вирусов в медицине, как правило, берутся:

    • носоглоточный смыв (респираторные инфекции);
    • смыв и фекалии (энтеровирусные инфекции);
    • соскобы, содержимое пузырьков (поражения кожи, слизистых оболочек, как герпес, ветряная оспа);
    • смывы (экзантемные инфекции, как корь, краснуха);
    • кровь, спинномозговая жидкость (арбовирусные инфекции).

    Фазы

    Все этапы вирусологического метода исследования включают в себя:

    • забор материала;
    • выбор, получение тест-системы, определение ее жизнеспособности;
    • заражение тест-системы;
    • индикация вируса;
    • определение типа вируса.

    В основном, патогенные вирусы отличаются наличием тканевой и типовой специфичности. Взять, к примеру, полиовирус, который репродуцируется только у приматов (в их клетках). Соответственно, для выделения определенного вируса используют определенную культуру ткани. Если речь идет о неизвестном возбудителе, то целесообразно будет одномоментно заразить три, а лучше четыре культуры клеток.

    Таким образом, возможно, одна из них окажется чувствительной. Чтобы определить наличие вируса в зараженных культурах, смотрят на развитие специфической дегенерации клеток, внутриклеточные включения, выявление специфического антигена, положительные реакции гемагглютинации и гемадсорбции.

    Все вирусологические методы исследования (прямые и непрямые, серологические) должны быть выбраны, как наиболее подходящие для конкретного случая предполагаемого инфицирования.

    Непрямые методы основываются на выделении и идентификации вируса. Они трудоемкие, длительные, но точные.

    Серодиагностика

    Под такой диагностикой подразумевается метод, основанный на реакции антиген-антитело. Чаще всего используют парные сыворотки крови, взятые с интервалом в несколько недель.

    Если нарастание титра антител в 4 и больше раз, реакцию считают за положительную. Чтобы определить типоспецифичность вируса, применяют реакцию вируснейтрализации.

    Для определения группоспецифичности нужно получить реакцию связывания комплемента.

    Широко используют различные варианты иммуноферментного анализа, реакции торможения гемагглютинации, пассивной гемагглютинации, обратной пассивной гемагглютинации, РИФ.

    Еще в генной инженерии был разработан метод получения моноклональных антител. Преодолеть узкую специфичность моноклонов можно применением нескольких моноклональных антител к различным вирусным детерминантам.

    Таким образом, была повышена специфичность и чувствительность исследования с определением антигенов.

    Некоторые особенности

    Сегодня создано много разных тест-систем для иммунологической диагностики инфекций, возникших вследствие попадания вируса в живой организм.

    Таким образом, вирусологические методы исследования – это способы выделения вирусов, изучение их свойств и установление их этиологической связи с определенными заболеваниями.

    Что касается животных, используемых в этих исследованиях, то они должны быть достаточно восприимчивы к определенной вирусной инфекции, они не должны являться носителями латентной инфекции и каких-то паразитов.

    Значение также имеет вид животного, его возраст, порода, вес тела, упитанность, половая принадлежность и условия содержания. В опыте участвуют животные одного вида, возраста, с одинаковыми условиями содержания.

    Иногда могут быть использованы разные виды животных, с различной чувствительностью к одному и тому же вирусу. Это помогает выявить все разнообразие инфекционных форм.

    Источник

    Источник: https://1Ku.ru/obrazovanie/29062-virusologicheskie-metody-issledovanija-v-mikrobiologii/

    10)Гемагглютинирующие и гемадсорбирующие свойства вирусов

    Индикация вирусов по гемадсорбции

    Бляшкообразование.«Бляшками»называют негативные колонии — участкиразрушенных клеток, выглядящие как зоныпросветления на монослоях клеток,покрытых слоем агара. В некоторых случаяхдозу и цитопатогенность вируса выражаютв бляшкообразующих единицах (БОЕ).

    Тельца включений.Многие вирусывызывают появление в заражённых клеткаххарактерных образований — скопленийвирусных белков или частиц, видимых всветовой микроскоп. Тельца включениймогут располагаться как в цитоплазме(тельца Гварнери при оспе), так и в ядрахклеток (аденовирусы).

    Отсутствие цитопатического эффекта.Некоторые вирусы (например, вирускраснухи) не проявляют цитопатическогоэффекта. Их можно выявлять по интерференциидругого вируса, способного вызыватьдегенерацию заражённых клеток.

    Феномен гемадсорбции.Многиезаражённые вирусами клетки приобретаютспособность сорбировать на своейповерхности различные эритроциты.Феномен гемадсорбции имеет общиемеханизмы с гемагглютинацией и проявляетсяна ранних сроках, до проявленияцитопатического эффекта, при егоотсутствии либо слабой выраженности.

    Торможение гемагглютинации.РТГАприменяют для идентификации вирусов,способных агглютинировать различныеэритроциты. Для этого смешиваюткультуральную среду, содержащуювозбудитель, с известной коммерческойантисывороткой и вносят в культуруклеток. После инкубации определяютспособность культуры к гемагглютинациии при её отсутствии делают заключениео несоответствии вируса антисыворотке.

    Торможение цитопатического эффектаинтерференцией вирусов.Реакциюторможения цитопатического эффекта засчёт интерференции вирусов применяютдля идентификации возбудителя,интерферирующего с известным цитопатогеннымвирусом в культуре чувствительныхклеток.

    Для этого в культуральную среду,содержащую изучаемый вирус, вносяткоммерческую сыворотку (например, квирусу краснухи при подозрении на неё),инкубируют и заражают вторую культуру;через 1-2 дня в неё вносят известныйцитопатогенный вирус (например, любойЕСНО-вирус).

    При наличии цитопатогенногоэффекта делают вывод о том, что перваякультура была заражена вирусом,соответствовавшим применённым AT.

    12)Методы идентификации вирусов

    Идентификация вирусов.

    Качественное определение.

    Наличие и биологическую активностьвирусов определяют по эффектам,наблюдаемым на животных моделях(повышение температуры тела, появлениехарактерных клинических признаков,гибель и т.д.), куриных эмбрионах и наклетках (в культурах).

    Под воздействиемконкретных вирусов возможно изменениеморфологии, роста, репродукции клетоклибо их разрушение.

    Факт размножениявирусов в чувствительных клетках invitroопределяют по цитопатическимэффектам (в том числе бляшкообразованию,тельцам включений), феномену гемадсорбции,«цветной реакции».

    Цитопатические эффектыоцениваютпри микроскопии клеточных культур. Постепени поражения клеток выделяютвирусы с высокой или умереннойцитопатогенностью. Размножение вирусовв культурах клеток сопровождаетсянарушениями морфологии клеток монослоя.

    Некоторые вирусы вызывают характерныецитопатические изменения, что (с учётомклинической картины заболевания)позволяет быстро поставить предварительныйдиагноз.

    Например, размножениепарамиксовирусов (вирусы кори, паротита,PC-вирус) сопровождается появлениемхарактерных гигантских многоядерныхклеток; аденовирусы вызывают образованиескоплений больших круглых клеток, а прирепродукции герпесвирусов клеткиокруглой формы диффузно располагаютсяпо всему монослою.

    Бляшкообразование.«Бляшками»называют негативные колонии — участкиразрушенных клеток, выглядящие как зоныпросветления на монослоях клеток,покрытых слоем агара. В некоторых случаяхдозу и цитопатогенность вируса выражаютв бляшкообразующих единицах (БОЕ).

    Тельца включений.Многие вирусывызывают появление в заражённых клеткаххарактерных образований — скопленийвирусных белков или частиц, видимых всветовой микроскоп. Тельца включениймогут располагаться как в цитоплазме(тельца Гварнери при оспе), так и в ядрахклеток (аденовирусы).

    Отсутствие цитопатического эффекта.Некоторые вирусы (например, вирускраснухи) не проявляют цитопатическогоэффекта. Их можно выявлять по интерференциидругого вируса, способного вызыватьдегенерацию заражённых клеток.

    Феномен гемадсорбции.Многиезаражённые вирусами клетки приобретаютспособность сорбировать на своейповерхности различные эритроциты.Феномен гемадсорбции имеет общиемеханизмы с гемагглютинацией и проявляетсяна ранних сроках, до проявленияцитопатического эффекта, при егоотсутствии либо слабой выраженности.

    «Цветная реакция».В культуральнуюсреду, используемую для поддержанияклеток, вносят индикатор. Рост клетоксопровождается накоплением метаболитов,сдвигом рН среды и изменением окраскииндикатора. Заражение культур вирусомрезко ингибирует клеточный метаболизм,и среда сохраняет первоначальный цвет.

    Экспресс-диагностика.Для быстройидентификации вирусной инфекцииразработаны многочисленные методыэкспресс-диагностики, основанные наобнаружении вирусных Аг. Например, дляранней диагностики ВИЧ-инфекции широкоиспользуют ИФА, выявляющий поверхностныеAr вируса.

    Количественное определение

    Количественное определение вирусовпроводят двумя путями — изучениеминфекционности и количественнымопределением вирусных Аг.

    Определениетитра инфекционности вирусов взначительной степени зависит от методаколичественного исследования; убактериофагов отношение инфекционность-частицасоставляет приблизительно 1 (то естькаждая вирусная частица способна вызватьинфекцию), для вирусов животных данноеотношение составляет 1:10 (иногда вышеиз-за вирусингибирующего действияфакторов резистентности).

    Определение инфекционности вирусов.Наиболее доступная форма количественногоопределения — подсчёт числа вирусных«бляшек».

    Прямые тесты на инфекционностьприменяют для установления инфекционнойдозы (ID) или летальной дозы (LD) изучаемоговируса (обычно выражают вlg ).

    ID50—разведение, инфицирующее 50% клеток;LD50—разведение, убивающее 50%поражённых клеток или животных.

    Выявление вирусных Аг и вирусныхчастиц.Наиболее распространённыйметод — реакция количественнойгемагглютинации. Метод основан наспособности вирусов сорбироваться наповерхности эритроцитов животных ичеловека. Количественную электроннуюмикроскопию применяют для подсчётаобщего числа вирусных (но не инфекционных)частиц в исследуемом обьекте (например,культуральной жидкости).

    Морфология вирусов

    Изучение морфологии вирусов возможнолишь при помощи электронной микроскопии,однако чаще всего этот метод недоступениз-за отсутствия столь дорогого исложного прибора. Более того, многиевозбудители морфологически сходны, чтоснижает ценность этого метода.

    Наиболеераспространён метод микроскопиисодержимого везикул и тканевых экстрактов,обработанных красителями (негативноеконтрастирование), с последующимподсчётом ДНК- или РHK-содержащих вирусов.

    Электронная микроскопия позволяетбыстро обнаружить орто- и парамиксовирусыв отделяемом дыхательных путей,герпесвирусы в жидкости везикул иротавирусы в фекалиях.

    Серологические методы идентификации

    При большинстве вирусных инфекцийразвиваются иммунные реакции, применяемыедля диагностики.

    Клеточные реакцииобычно оценивают в тестах цитотоксичностилимфоцитов в отношении инфекционныхагентов или заражённых ими клеток-мишенейлибо определяют способность лимфоцитовотвечать на различные Аг и митогены.

    Вработе практических лабораторийвыраженность клеточных реакций определяютредко. Большее распространение нашлиметоды идентификации противовирусныхAT.

    РН основана на подавлении цитопатогенногоэффекта после смешивания вируса соспецифичными AT. Неизвестный вируссмешивают с известными коммерческимиантисыворотками и после соответствующейинкубации вносят в монослой клеток.Отсутствие гибели клеток указываетна несоответствие инфекционного агентаи известных AT.

    Торможение гемагглютинации.РТГАприменяют для идентификации вирусов,способных агглютинировать различныеэритроциты. Для этого смешиваюткультуральную среду, содержащуювозбудитель, с известной коммерческойантисывороткой и вносят в культуруклеток. После инкубации определяютспособность культуры к гемагглютинациии при её отсутствии делают заключениео несоответствии вируса антисыворотке.

    Торможение цитопатического эффектаинтерференцией вирусов.Реакциюторможения цитопатического эффекта засчёт интерференции вирусов применяютдля идентификации возбудителя,интерферирующего с известным цитопатогеннымвирусом в культуре чувствительныхклеток.

    Для этого в культуральную среду,содержащую изучаемый вирус, вносяткоммерческую сыворотку (например, квирусу краснухи при подозрении на неё),инкубируют и заражают вторую культуру;через 1-2 дня в неё вносят известныйцитопатогенный вирус (например, любойЕСНО-вирус).

    При наличии цитопатогенногоэффекта делают вывод о том, что перваякультура была заражена вирусом,соответствовавшим применённым AT.

    Прямая иммунофлюоресценция.Средипрочих тестов наибольшее распространениенашла реакция прямой иммунофлюоресценции(наиболее быстрая, чувствительная ивоспроизводимая).

    Например, идентификацияЦМВ по цитопатогенному эффекту требуетне менее 2-3 нед, а при использованиимеченых моноклональных AT идентификациявозможна уже через 24 ч.

    Имея наборподобных реагентов, их можно вносить вкультуры, заражённые вирусом, инкубировать,отмывать не связавшийся реагент иисследовать с помощью люминесцентноймикроскопии (позволяет выявить наличиефлюоресценции заражённых клеток).

    Иммуноэлектронная микроскопия(аналог предыдущего метода) позволяетидентифицировать различные виды вирусов,выявленные электронной микроскопией(например, различные виды герпесвирусов),что невозможно сделать, основываясь наморфологических особенностях. Вместоантисывороток для идентификациииспользуют помеченные разными способамиAT, но сложность и дороговизна методаограничивают его применение.

    Выявление противовирусных AT в сыворотке

    Более простой и доступный подход —выявление противовирусных AT в сыворотке.Образцы крови необходимо отбиратьдважды:немедленно после появленияклинических признаков и через 2-3 нед.Чрезвычайноважно исследовать именнодва образца сыворотки.

    Результатыоднократного исследования нельзясчитать окончательными из-за невозможностисвязать появление AT с настоящим случаем.Вполне возможно, что эти AT циркулируютпосле предшествующей инфекции. В подобнойситуации роль исследования сыворотки,полученной в период реконвалесценции,трудно переоценить.

    На наличие заболеванияв период отбора первой пробы указываетне менее чем четырёхкратное увеличениетитра AT,выявленное при исследованиивторой пробы.

    Перечисленные ниже методы не позволяютдифференцировать AT, образующиеся вовремя болезни и циркулирующие послевыздоровления (продолжительность этогопериода вариабельна для различныхинфекций).

    Поскольку для адекватнойдиагностики необходимо подтвердитьдостоверное увеличение титров AT в двухпробах, то первую пробу исследуют вострой фазе, а вторую — в периодвыздоровления (через 2-3 нед).

    Полученныерезультаты носят ретрос пективныйхарактер и более пригодны для проведенияэпидемиологических обследований.

    РТГАвыявляет AT, синтезируемыепротив гемагглютининов вирусов (например,вируса гриппа). Метод позволяет легковыявлять подобные AT в сыворотке больного.

    РСК— основной метод серодиагностикивирусных инфекций (среди доступных).Реакция выявляет комплементсвязывающиеIgM и IgG, но не дифференцирует их; дляоптимизации получаемых результатовпостановка реакции требует определённыхнавыков персонала.

    РИФ.При возможности получить биоптатинфицированной ткани и доступностикоммерческих наборов AT, меченныхфлюоресцеином, диагноз может подтвердитьреакция прямой иммунофлюоресценции.Постановка реакции включает инкубациюисследуемой ткани с AT, их последующееудаление и люминесцентную микроскопиюобразца.

    Иммуносорбционные методы(например,ИФА и РИА) более информативны, посколькувыявляют IgM и IgG по отдельности, чтопозволяет делать определённые выводыо динамике инфекционного процесса илисостоянии реконвалесценции.

    Для выявленияAT известный Аг сорбируют на твёрдомсубстрате (например, на стенках пробирок,пластиковых микропланшетах, чашкахПетри) и вносят различные разведениясыворотки пациента.

    После соответствующейинкубации не связавшиеся AT удаляют,вносят антисыворотку кlgчеловека,меченную ферментом, повторяют процедуруинкубирования и отмывания несвязанныхAT и вносят какой-либо хромогенныйсубстрат (чувствительный к действиюфермента).

    Поскольку изменение окраскипропорционально содержанию специфическихAT, то вполне возможно определение ихтитра спектрофотометрическим способом.В диагностике ВИЧ-инфекции наибольшеераспространение нашёл метод иммуноблотинга.

    Выявление вирусных Аг

    ИФА.В настоящее время уже появилиськоммерческие наборы для выявления Агнекоторых возбудителей, позволяющиеих идентифицировать в течение 5-10 мин.

    Для выявления Аг на твёрдой фазе сорбируютизвестные AT и добавляют сыворотку,содержащую Аг; после инкубированиянесвязанный Аг декантируют, системупромывают и вносят меченые AT, специфичныек сорбированным AT.

    Повторяют процедуруинкубирования и отмывания, вносятхромогенный субстрат, положительныйрезультат фиксируют при измененииокраски системы.

    Гибридизация ДНК— высокоспецифичныйметод, позволяющий идентифицироватьгеном вируса после его гибридизациикомплементарными молекулами ДНК. Вкачестве маркёра  применяют ферментыи изотопы.

    Метод определяет способностьвирусной ДНК гибридизироваться с меченойкомплементарной ДНК; специфичностьметода прямо пропорциональна длине Iкомплементарной цепочки. Перспективенметод гибридизации нуклеиновых кислотin situ.

      Для постановки реакции меченуюДНК наносят на биоптаты тканей (в томчисле на фиксированные формалином илизаключённые в парафиновые блоки) ирегистрируют взаимодействие скомплементарной ДНК. Метод используютдля выявления вирусов простого герпеса,папилломы человека, Эпстайна-Барр и др.

    ПЦР.Метод значительно увеличиваетчувствительность метода гибридизации,повышая содержание вирусной ДНК вматериале, полученном от больного, атакже ускоряет время получения результата.

    16

    Источник: https://studfile.net/preview/3883388/page:7/

    Советы доктора
    Добавить комментарий

    ;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: