Выделение и культивирование вирусов

Культивирование вирусов — особенности, способы и интересные факты

Выделение и культивирование вирусов

21-й век — это век, совершающий семимильные шаги в области технологического прогресса, стремительно развиваются наука и медицина. Современный уровень прогресса позволяет претворить в жизнь то, что раньше казалось человеку невозможным. Постиндустриальная стадия развития человечества нацелена на высокие технологии, инновации во всех сферах.

Особенно быстро развивается медицина: большинство болезней, считавшихся ранее неизлечимыми, теперь таковыми не являются. Так, например, культивирование вирусов позволяет создавать профилактические препараты: вакцины и сыворотки, предотвращающие эпидемии чумы, оспы и других смертельно опасных болезней.

Что такое культивирование?

Культивирование (от лат. cultivo – возделывать) представляет собой процесс разведения и выращивания чего-либо в искусственных условиях. В медицине, а точнее в эпизоотологии – частном ответвлении от ветеринарной медицины, культивирование является основным процессом, позволяющим изучать воздействие вируса на живой организм.

На основании полученной информации фармацевты изготавливают противовирусные препараты, создают методики, позволяющие в будущем противодействовать выявленным микроорганизмам. Выделение вирусов из зараженного материала также позволяет сохранять их для дальнейшего использования.

История эпизоотологии

Еще в 1879 году французский ученый В. Гальтье впервые предпринял попытку культивировать вирус. Его выбор пал на такое заболевание, как бешенство: он выделил неклеточный агент этой болезни посредством заражения кролика кровью больной собаки.

В 1919 году у немца А. Левенштейна получилось заразить вирусом герпеса, взятым у человека, кролика. Годом позже его соотечественник В. Грютер подтвердил опыт своего коллеги и доказал, что подобная культивация на кроликах возможна.

В 1925 году двое ученых – Ф. Паркер и Б. Най – доказали, что вирус коровьей оспы в состоянии воспроизводиться в тканях организма животных. 6-ю годами позже Вудрафф и Э. Гудпасчер заявили, что культивация вируса оспы птиц может проводиться на оболочке куриных эмбрионов, тем самым открыв научному миру новый метод репродукции вирусов.

Процесс заражения клетки

Процесс культивирования вируса невозможен без наличия реагирующей на него клетки.

Когда клетка найдена (это могут быть клетки куриных эмбрионов, части тканей, органов или даже целые животные), в нее вводится нуклеиновая кислота вируса, которая перепрограммирует генетическую информацию искомой клетки, заменяя ее своей.

Обычно вредоносной частице удается поселиться в клетке, даже несмотря на систему противовирусной защиты и вырабатываемые организмом интерфероны.

После того как вирус проник через мембрану клетки, он начинает размножаться, проходя через 3 стадии. Сначала происходит транскрипция генома закрепившегося вируса, что означает перенос информации из системы ДНК в РНК, которая в последующем синтезируется в ускоренном темпе. Следующий этап – образование и созревание белков, которые послужат каркасом для дочерних вирусных тел.

На последней, заключительной стадии новосинтезированные вирусные тела увеличиваются в количестве. Когда их становится слишком много, разрывают мембрану и выходят из клетки, в которой изначально закрепился вирус.

Стоит отметить, что образование вирионов (дочерних тел данного микроорганизма) не всегда приводит к гибели клетки-хозяина.

Некоторые способны отпочковываться от мембраны, не вызывая ее разрыва, в то время как клетка продолжает производить вирусные тела.

Микробиология и ее методы

С течением времени биология, как наука, развивалась и впитывала в себя новые факты. Постепенно усложняясь, от нее стали отпочковываться разные направления: биомеханика, гидробиология, вирусология, космическая биология и многие другие.

Такой раздел, как микробиология, изучает процессы жизнедеятельности микроорганизмов, в том числе и посредством заражения подопытного лабораторного животного вирусом.

Таким образом, в микробиологии культивирование вирусов считается одним из основных способов получения информации, являясь ключевым инструментом биологического метода исследования.

Помимо биологического метода, суть которого заключается в исследовании действия вируса на организм животного и последующей его культивации, существуют и некоторые другие.

Во многих случаях вредоносными микроорганизмами заражают куриные эмбрионы, поскольку довольно крупная доля вирусов, известных на сегодняшний день науке, способна реплицироваться именно в этой форме жизни.

Однако чаще всего биологи в качестве рабочего материала используют тканевые культуры, поскольку они наиболее продуктивны в качестве метода культивирования.

Вирус и тканевые культуры

Тканевая культура представляет собой некую систему клеток в виде суспензии. Это слой определенного размера, обычно в одну клетку, который помещается на стекло сосуда. Чаще других используется первичная монослойная ткань. Добиться монослойности довольно трудно, сначала выбранную ткань (обычно это ткань сердца, плаценты или почек животных) нужно измельчить.

После измельчения биологи применяют расщепляющий белок фермент – трипсин, который разъединяет клетки ткани, уничтожая между ними межклеточную связь.

После достижения разъединения клеток необходимо отмыть их от фермента и поместить в питательную среду, чтобы обеспечить рост получившейся клеточной культуры.

Данной средой может послужить среда 199, которая характерна высоким содержанием глюкозы, солей и разных витаминов. Меняется питательная среда по прошествии 2–3 дней.

Кроме первичной ткани для культивирования вирусов также применяются так называемые перевариваемые ткани, которые, в свою очередь, делятся на нормальные и опухолевые.

Они более стойкие, чем первичные, и способны длительно размножаться. Нормальными тканями могут послужить органы животных: почки барана, сердце обезьяны.

В качестве опухолевых тканей обычно берут клетки HeLa, выделенные изначально из рака шейки матки, или клетки Hep-3, взятые из рака лимфы.

Вирус и куриные эмбрионы

Большинство известных науке вирусов можно выращивать в куриных эмбрионах. Они очень жизнеспособны и устойчивы к негативным внешним воздействиям.

Срок, на котором заражается эмбрион, зависит от задач исследования и вида вируса, но обычно не превышает двух недель.

Так, например, чтобы провести культивирование вируса гриппа, нужен 9-10-дневный эмбрион, а для того чтобы вырастить вирус паротита, достаточно и недельного эмбриона.

При работе с куриным эмбрионом все его зачатки тканей подвергаются заражению. Результативность культивации можно увидеть на финальной стадии: это может быть гибель эмбриона, а также дефекты развития в виде появления на оболочках эмбриона бляшек, состоящих из вирусных частиц – вирионов.

В любом случае данный метод культивирования и индикации вирусов имеет существенный недостаток, заключающийся в необходимости вскрытия эмбриона для захвата воспроизведенного вируса. Также полученная субстанция имеет в себе высокую концентрацию белка, который нужно удалить, чтобы вывести чистый инфекционный агент для дальнейшего производства медикаментов.

Вирус и организмы животных

В настоящее время использование лабораторных животных в качестве биологического материала в силу своей негуманности ограничено с 1986 года Европейской конвенцией о защите позвоночных животных.

Несмотря на это, многие виды животных: мыши и крысы, хорьки и кролики, овцы, собаки и обезьяны – все равно используются в лабораторных работах и экспериментах, поскольку некоторые вирусы способы к репликации только в живых организмах.

Культивирование вирусов в организме животных проводится по-разному: для воспроизведения нейротропных вирусов (бешенство, энцефалит) заражается мозг животного, для создания респираторных (грипп) производится интраназальное заражение, для дерматотропных (оспа) – накожное и подкожное инфицирование.

Чаще прочих для культивации используются грызуны: мыши и крысы, сирийские хомячки, свинки. Их заражают нейротропными инфекционными агентами, аденовирусами, лимфоцитарным хориоменингитом посредством введения вредоносного микроорганизма в мозг или брюшную полость.

Некоторые вредоносные микроорганизмы гораздо быстрее развиваются в телах молодых особей, поэтому онкогенными вирусами заражаются в основном новорожденные крысы и сирийские хомячки. Без них также невозможно обойтись при культивации вирусов Коксаки.

Стоит отметить, что биологический метод культивирования вирусов в микробиологии тоже имеет свои изъяны. Во-первых, организмы лабораторных животных загрязняются вирусами, в силу чего они испытывают недомогание.

Во-вторых, чтобы получить чистый инфекционный агент, нужно провести его через другие культуры клеток, что увеличивает продолжительность исследования.

Показатели успеха заражения

Культивирование и индикация вирусов – два неразрывных процесса. Индикация позволяет понять, смог ли микроорганизм ужиться в зараженной клетке и получилось ли у него развиваться дальше.

Говорить о факте репликации можно, если у животного наблюдаются основные признаки заболевания, а также если органы и ткани подверглись патоморфологическим изменениям.

Часто в качестве индикации используется реакция гемагглютинации, которая показывает степень распространения вируса на основе выделяемого им белка гемагглютинина.

Современные особенности культивирования вирусов

Прогресс не стоит на месте, во всех научных сферах появляются инновационные методы, технологии. Микробиология и вирусология не являются исключением.

Теперь вместо простого размещения клеточной культуры на сосудах применяется роллерный метод, при котором используемый материал находится на нескольких цилиндрических поверхностях, вращающихся по окружности и периодически омываемых питательной средой.

Данный метод хорош тем, что он увеличивает число получаемых клеток и требует меньший расход питательного материала.

Общий вывод

Культивировать вирусы, то есть создавать их в искусственных средах, человек начал совсем недавно.

Поначалу заражались организмы животных с целью изучения принципа действия инфекционных агентов и выработки препаратов против них.

Благодаря микробиологии, вирусологии и эпизоотологии человечество избавилось от таких смертельной опасности таких заболеваний, как чума, туберкулез, бешенство, корь.

Сейчас для культивации вирусов в основном используются отдельные тканевые культуры и куриные эмбрионы. Посредством различных манипуляций живые клетки заражаются, в них происходит созревание вирусных тел, которые потом выходят за клеточное пространство. Созревшие вирусы собираются биологами для дальнейшего изучения.

Источник: https://News4Auto.ru/kyltivirovanie-virysov-osobennosti-sposoby-i-interesnye-fakty/

Диагностика коронавирусной инфекции (COVID-19; SARS-CoV-2)

Выделение и культивирование вирусов

Чувствительность анализа в большой степени зависит от качества образца, методов и сроков сбора.

Типы образцов: отделяемое верхних дыхательных путей (мазки из зева, мазки из носа, носоглоточные секреты), отделяемое нижних дыхательных путей (мокрота, отделяемое дыхательных путей, жидкость из бронхоальвеолярного лаважа), кровь, кал, моча и отделяемое конъюнктивы.

Образцы мокроты и других выделений нижних дыхательных путей являются предпочтительным материалом для анализа, так как имеют высокий коэффициент позитивности нуклеиновых кислот.

SARS-CoV-2 преимущественно распространяется в альвеолярных клетках II типа (AT2), пик выделения вируса наступает через 3-5 дней после начала заболевания. Поэтому, даже если первый тест на нуклеиновые кислоты оказался отрицательным, материал следует продолжать собирать и тестировать в последующие дни.

Анализ на наличие нуклеиновых кислот является предпочтительным методом диагностики SARS-CoV-2.

Процедура тестирования согласно приведенным в наборе инструкциям выглядит следующим образом: образцы подвергаются предварительной обработке, вирус подвергается лизису для выделения нуклеиновых кислот.

Три специфических гена SARS-CoV-2, а именно: открытая рамка считывания 1a/b (ORF1a/b), гены нуклеокапсидного белка (N) и белка оболочки (E) затем амплифицируются по методике количественной ПЦР в реальном времени.

Амплифицированные гены обнаруживаются по интенсивности флуоресценции. Критерии положительных результатов анализа на нуклеиновые кислоты: положительный тест на ген ORF1a/b и (или) ген N (ген E).

Комбинированное обнаружение нуклеиновых кислот из разных типов образцов может повысить точность диагностики. Среди пациентов с подтвержденным положительным анализом на нуклеиновую кислоту в дыхательных путях около 30%–40% также показали нуклеиновую кислоту вируса в крови и около 50%–60% в кале.

В то же время доля положительных анализов в образцах мочи была довольно низкой. Комбинированное тестирование, включающее образцы отделяемого из дыхательных путей, фекалий, крови и др.

помогает повысить чувствительность диагностики у пациентов с подозрением на новую коронавирусную инфекцию, лучше контролировать эффективность лечения и определять меры изоляции после выписки.

Выделение и культивирование вируса

Посев культуры вируса должен проводиться в лаборатории с уровнем биобезопасности 3 (BSL-3). (Соответствует 2 уровню биологической безопасности в России – Прим. пер.). Процесс кратко описывается следующим образом: получены свежие образцы мокроты, кала и т. д., клетки Vero E6 cells инокулированы материалом от больных для культивирования вируса.

Цитопатический эффект (ЦПЭ) наблюдается через 96 часов. Обнаружение нуклеиновой кислоты вируса в культуральной среде свидетельствует об успешном культивировании.

Определение титра вируса: после последовательного разведения вирусного посевного материала в 10 раз TCID50 определяется микроцитопатическим методом либо подсчетом числа бляшкообразующих единиц (БОЕ).

Обнаружение антител в сыворотке

После заражения SARS-CoV-2 вырабатываются специфические антитела. Методы определения сывороточных антител включают иммунохроматографию с коллоидным золотом, ИФА, хемилюминесцентный иммуноанализ и т. д.

Положительный специфический IgG может использоваться в качестве критерия диагностики у пациентов с подозрением на новую коронавирусную инфекцию с отрицательным анализом на наличие нуклеиновых кислот.

Титр специфических антител IgG в фазе выздоровления примерно в 4 раза выше, чем в острой фазе; IgM обнаруживается через 10 дней после появления симптомов; а IgG обнаруживается через 12 дней после появления симптомов. Вирусная нагрузка постепенно уменьшается с повышением уровня сывороточных антител.

Исследование показателей воспалительного процесса

Рекомендуется проводить анализы на содержание С-реактивного белка, прокальцитонина, ферритина, D-димера, общих лимфоцитов и субпопуляций лимфоцитов, интерлейкинов IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α, INF-γ и других индикаторов воспаления и иммунного статуса, что может помочь оценить клиническое развитие, предупредить серьезные и критические тенденции и послужить основой для разработки стратегии лечения.

У большинства больных с CОVID-19 наблюдается нормальный уровень прокальцитонина при значительно повышенном уровне С-реактивного белка. Быстро и значительно растущий уровень С-реактивного белка указывает на возможность вторичной инфекции. Уровень D-димера значительно повышается в тяжелых случаях, что является потенциальным фактором риска и основанием для плохого прогноза.

У пациентов с низким общим количеством лимфоцитов в начале заболевания, как правило, плохой прогноз. У тяжелых больных прогрессивно снижается количество лимфоцитов периферической крови. У пациентов с тяжелым течением болезни значительно повышен уровень экспрессии IL-6 и IL-10. Мониторинг уровня IL-6 и IL-10 полезен для оценки риска перехода заболевания в тяжелую форму.

Исследование на вторичные бактериальные и грибковые инфекции

Больные в тяжелом и критическом состоянии подвержены вторичным бактериальным или грибковым инфекциям. Материал для анализа бактериальной или грибковой культуры собирается с места заражения.

Если есть подозрение на вторичную инфекцию легких, для культивирования следует собирать мокроту, выделяемую при кашле из глубины легких, аспират из трахеи, жидкость БАЛ и соскобы. У пациентов с высокой температурой следует своевременно проводить посев крови.

Взятие крови из периферических вен или катетеров следует проводить у пациентов с подозрением на сепсис, у которых стоит постоянный катетер. Рекомендуется брать у них анализ крови на иммуноглобулины G и на GM по крайней мере два раза в неделю в дополнение к посеву на грибок.

Техника безопасности

Подробнее…

Защитные меры биобезопасности принимаются в соответствии с уровнем риска экспериментального процесса. Индивидуальная защита применяется в соответствии с требованиями лабораторной защиты BSL-3 (соответствует 2 уровню биологической безопасности в России – Прим. пер.

) для сбора образцов отделяемого из дыхательных путей, исследования на наличие нуклеиновых кислот и действий по культивированию вируса.

Средства индивидуальной защиты в соответствии с требованиями лабораторной защиты BSL-2 (соответствует 3 уровню биологической безопасности в России – Прим. пер.) применяются при биохимических, иммунологических исследованиях и других обычных лабораторных исследованиях.

Образцы следует перевозить в специальных транспортных контейнерах, отвечающих требованиям биобезопасности. Все лабораторные отходы только автоклавируются.

Источник: РУКОВОДСТВО ПО ПРОФИЛАКТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ НОВОЙ КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ COVID-19

Первая академическая клиника Университетской школы медицины провинции Чжэцзян. Составлено на основе клинической практики

Коронавирусы (Coronaviridae) – это большое семейство РНК-содержащих вирусов, способных инфицировать человека и некоторых животных.

Подробнее…

Внимание! информация на сайте не является медицинским диагнозом, или руководством к действию и предназначена только для ознакомления.

Источник: https://doclvs.ru/medpop/diagcovid.php

Советы доктора
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: